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TERESA CRISTINA SOARES DE LIMA GRISI
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Diversidade de Bacteria e Archaea do solo do Cariri paraibano e prospecção de celulases e xilanases em clones metagenômicos e isolados bacterianos
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Fecha: 01-dic-2011
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Hora: 14:00
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No capítulo 1 desse trabalho, amostras do solo da pastagem nativa (sítio A) e sob cultivo do capim marrequinho (Paspalum conjugatum, Bergius) (sítio B), coletadas na região semi-árida do bioma Caatinga, Paraíba, (07°23’27”S 36°31’58”O), foram utilizadas para construção de quatro bibliotecas de clones metagenômicos, para avaliação da diversidade microbiana pela amplificação do gene 16S rRNA dos domínios Bacteria e Archaea, de cada amostra de solo. Os DNA metagenômicos foram extraídos utilizando FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), os quais foram amplificados por PCR utilizando primers universais, 27F / 1525R (Bacteria) e 20F / 958R (Archaea). Os fragmentos purificados foram ligados ao vetor pGEM Teasy e transformados por choque térmico em Escherichia coli DH10B quimicamente competente. Os transformantes foram cultivados em meio Agar LB/Ampicilina (100 µ/mL), IPTG (800 µg/µL) e XGal (80 µg/µL), a 37ºC/18-20 h. Foram selecionados 250 clones de cada biblioteca os quais foram sequenciados e após descarte das sequências de baixa qualidade e quiméricas, foram obtidas 64 e 68, 89 e 141 sequências para Bacteria e Archaea, nos solos dos sítios A e B, respectivamente, as quais foram comparadas em banco de dados públicos RDB e NCBI (≥95% de similaridade). No sítio A o filo Acidobacteria (48,4%) foi o mais abundante, seguido dos filos Bacteroidetes (10,9%), Proteobacteria (10,9%), e Firmicutes (6,3%). No sítio B Proteobacteria (45,6%) foi o de maior destaque, seguido de Firmicutes (10,3%), Acidobacteria (8,8%), Bacterioidetes (7,3%); e ainda Cyanobacteria (1,5%) e Planctomycetes (1,5%), que não foram encontrados no sítio A. Entre as sequências geradas, 23,4% (sítio A) e 25,0% (sítio B) não foram classificadas (similaridade <95%). No domínio Archaea foram encontrados os filos Euryarchaeota (3,4 e 45,4%) e Crenarchaeota (2,2 e 3,5%), nos sítios A e B, respectivamente; destacando-se que 94,4% e 51,1% das sequências não foram classificadas (similaridade <95%), entre os sítios A e B, respectivamente. Uma maior diversidade (índice de Shannon), riqueza (índice Chao 1) e distribuição (índice de equidade) das comunidades foram observadas no nível de espécies, tanto para Bacteria como para Archaea, nos dois sítios. As bibliotecas de clones metagenômicos 16S rRNA de Bacteria e Archaea, quando comparadas, utilizando-se o programa Libshuff, diferiram significativamente (p<0,0001). Os resultados desse estudo mostraram a ocorrência de uma grande diversidade de bactérias e arqueas, nesse tipo de ambiente pouco estudado e com características peculiares de temperatura elevada e limitações hídricas, com possibilidade de busca de novos genes e/ou isolados microbianos, com potencial biotecnológico. No capítulo 2 desse trabalho, foi investigado o potencial de produção de celulases e xilanases de clones metagenômicos e de cepas bacterianas de uma amostra do solo nativo da Caatinga, do Cariri paraibano. Foram utilizados dois procedimentos: solo pré-enriquecido (PE) (25 g do solo em 225 mL em meio contendo 1% de CMC), a 37ºC/18-20h, a 200 rpm, utilizado tanto para extração do DNA metagenômico do solo (Kit MOBIO), como para isolamento de cepas bacterianas a 37ºC e a 50ºC; e solo não-enriquecido (NE) (25 g do solo em 225 mL de solução salina 0,9%), do qual foram igualmente isoladas bactérias a 37ºC e a 50ºC. O DNA metagenômico do solo (PE) foi quantificado e fragmentado com EcoRI, obtendo-se bandas, entre 4 a 5 kb e 9 a 10 kb, que após purificação foram ligadas em vetor pBC SK, transformados em E. coli DH10B, por choque térmico, as quais foram cultivadas em Agar LB/Amplicilina (100 µ/mL), IPTG e XGal, a 37ºC (18-20 h). Das colônias brancas obtidas foram selecionados 3.840 clones, que foram repassados para placas 96 poços e estocados a -80ºC, dos quais 1.920 clones foram utilizados para avaliação das produções enzimáticas. Entre os clones testados foram obtidos 60 para produção de celulase e 10 para produção de xilanase; sendo então selecionados quatro clones xilanolíticos para extração plasmidial e re-transformação em E. coli, os quais confirmaram atividade para xilanase. Dos solos PE e NE foram isoladas 42 cepas, entre as quais, três isoladas do solo PE (Cel55-01; Cel55-02 e Cel37-03), identificadas pela amplificação do gene 16S rRNA como Bacillus subtilis e duas do solo NE (Cel37-28 e T2), denominadas Paenibacillus illinoisensis e P. favisporos, respectivamente. As cepas Cel55-01, Cel55-02 e Cel37-03 obtiveram baixo rendimento para celulase (0,050 a 0,061 U/mL) e xilanase (0,011 a 0,036 U/mL), avaliados pelo método de Somogyi-Nelson, quando cultivadas em LB/palha de arroz. No entanto, a cepa Cel55-01, quando cultivada em LB/bagaço de cana-de-açúcar, teve seu rendimento aumentado em cerca de dez vezes em relação à xilanase (0,30 U/mL), com temperatura e pH ótimos a 50ºC e. 6,0, respectivamente. As cepas Cel37-28 e T2 apresentaram atividade de 1,30 U/mL e 1,0 U/mL, após 2 min de reação, e 0,92 U/mL e 0,90 U/mL, após 15 min, respectivamente, quando cultivas em LB/palha de arroz. Para as cepas Cel37-28 e T2, as temperaturas e pH ótimos foram, 55ºC e 60ºC e 7,5, respectivamente. As celulases visualizadas em gel SDS-PAGE (Zimograma) para a cepa Cel55-1 se apresentaram na faixa de 130 a 210 kDa, enquanto que as xilanases da cepa Cel37-28 ficaram em torno de 70 a 180 kDa; e da cepa T2, entre 50 e 130 kDa, evidenciando a produção de mais de uma enzima pelas cepas. Esses dados mostram que no solo do Cariri paraibano, região com características peculiares, como temperaturas altas e escassez hídrica, é possível a obtenção, tanto de clones metagenômicos funcionais, como isolados bacterianos, que produzem celulases e xilanases, a partir de resíduos industriais, a temperaturas acima de 50ºC e pH tendendo ao alcalino, de grande interesse nas indústrias têxteis e de celulose e papel.
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