A maioria das pesquisas em epidemiologia molecular, diagnóstico molecular e genética evolutiva
são confrontadas com o gerenciamento de grandes volumes de dados. Além disso, os dados utilizados em estudos de doenças patogênicas são complexos e geralmente derivam de instituições
tais como hospitais ou laboratórios. Embora já existam propostas que conecte informações moleculares ao diagnóstico de patogenias, nenhuma delas utilizam ferramentas de bioinformática de
alto desempenho incorporadas a um sistema e vinculada a um prontuário eletrônico do paciente.
MolEpi foi desenvolvido como um sistema de gerenciamento de dados e informações dimensionado
a saúde pública, incorporando informações clínicas e epidemiológicas sobre pacientes e dados
moleculares de sequências do gene rRNA 16S de bactérias patogênicas. Para identificação destas
bactérias foram utilizadas amostras biológicas (urina, secreções e purulentas de feridas, aspirado
traqueal e sangue) e PCR seguida de sequenciamento e análise da região conservada codificadora
de RNA ribossômico (rDNA) 16S. Este estratégia permite uma identificação bacteriana rápida,
independente de conhecimento prévio da espécie de microrganismo em estudo. O MolEpi é um sistema facilmente atualizável com as sequências específicas de bancos como Genbank(NCBI), RDP-II (Ribosomal Database Project - MSU) e GreenGene (LBL). A partir da confirmação e validação
das sequências dos isolados clínicos, estas podem ser utilizadas como referência na identificação
de outros microrganismos desconhecidos. Neste sentido, foi estabelecido um banco de dados local,
representativo do perfil de patógenos encontrados na unidade hospitalar de estudo e objeto
de vigilância epidemiológica. Para o desenvolvimento do MolEpi, utilizamos a linguagem Java e
banco de dados PostgreSQL8.3. Foi desenvolvido também o BACSearch, que possui os seguintes
programas: para o processamento de sequências de rDNA 16S utilizamos os frameworks BioJava;
para alinhamento múltiplo foi implementado o ClustalW2, MAFFT e o MUSCLE e para edição do
alinhamento múltiplo e análise filogenética foi utilizado JalView R 2.4.0b2. O sistema foi validado
com 200 espécimes clínicos identificadas e isoladas de sítios de infecção hospitalar. As sequências
de DNA produzidas a partir destas amostras foram submetidas ao BLAST, utilizando a ferramenta
desenvolvida, identificando Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiela pneumonie e Staphylococcus aureus como os principais patógenos correspondentes. Os dados sobre o padrão de resistência das espécies foram obtidos em laboratório de microbiologia e incorporados ao banco de dados. A aplicação do MolEpi ao Sistema Único de Saúde poderá fornecer diagnósticos mais rápidos, precisos, e interligados a uma rede de informações relevantes para o profissional de
saúde.

O 4-terpineol (4TRP) é um monoterpeno álcool monocíclico, que pode ser encontrado em óleos essenciais de plantas aromáticas diversas. Vários estudos têm relatado os efeitos apresentados por monoterpenos estruturalmente análogos ao 4TRP sobre o Sistema Nervoso Central (SNC). Justificando-se pela lacuna existente na farmacoterapia das epilepsias, a realização deste trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos psicofarmacológicos do 4TRP. Camundongos (Mus musculus) Swiss, machos e ratos (Rattus novergicus) Wistar, machos foram utilizados. Nos experimentos in vivo, o 4TRP foi administrado em doses variando entre 25 a 200 mg/kg, i.p., e nas concentrações de 10, 20 e 40 ng/2µL, i.c.v. Para os experimentos in vitro, as concentrações utilizadas foram 0,1 mM e 1,0mM. Como triagem farmacológica, para investigar o perfil de ação deste monoterpeno no SNC, foram realizados inicialmente testes gerais comportamentais como o teste da movimentação espontânea, potencialização do tempo de sono induzido por pentobarbital e o teste da barra giratória para investigar o perfil de ação deste monoterpeno no SNC. Em todas essas metodologias, os resultados obtidos sugerem que este apresenta perfil de droga psicoléptica, sem alterar, no entanto, a coordenação motora dos animais de forma significativa. Posteriormente, para avaliar possíveis efeitos ansiolíticos, foram realizados os testes do labirinto em cruz elevado (LCE) e o teste da placa perfurada. Nesses experimentos, nas doses testadas, o 4TRP não apresentou indicativos consistentes de atividade ansiolítica. Em seguida, foram realizados testes com o objetivo de avaliar a possibilidade de esta substância apresentar um perfil de atividade anticonvulsivante. De acordo com os parâmetros comportamentais avaliados, 4TRP (via i.p.), foi capaz de inibir convulsões induzidas tanto pelo pentilenotetrazol (PTZ) como pelo eletrochoque máximo (ECM), apresentando um potencial efeito anticonvulsivante. Em uma etapa posterior, acompanhando os animais através de registros eletroencefalográficos, percebe-se que animais tratados com 4TRP (via i.c.v.), foram protegidos contra convulsões induzidas por PTZ, corroborando com os resultados da etapa anterior. Para uma caracterização dos possíveis mecanismos pelos quais esta substância exerce sua ação, buscou-se evidenciar a participação do sistema GABAérgico empregando as metodologias: convulsões induzidas pela picrotoxina (PIC) e convulsões induzidas pelo ácido 3-mercapto-propiônico (3-MP). Em conformidade com os resultados, pode-se afirmar que a ação deste monoterpenóide está relacionada ao sistema GABAérgico e ainda que a presença do flumazenil, um antagonista seletivo do sítio benzodiazepínico dos receptores GABA_A, não foi capaz de reverter o efeito anticonvulsivante de 4TRP, demonstrando que este não atua no mesmo sítio de ligação dos benzodiazepínicos. Em uma etapa subsequente, utilizando a técnica de “Patch Clamp-Whole Cell”, demonstrou-se que 4TRP foi capaz de inibir significaticamente a corrente de canais de sódio dependentes de voltagem em células isoladas de neurônios de gânglios da raiz dorsal (GRD), estando o seu efeito, possivemente relacionado à mudanças na excitabilidade neuronal em conseqüência da modulação desses canais. Conclui-se que 4TRP apresenta efeitos psicofarmacológicos, com perfil de fármaco anticonvulsivante, que seu mecanismo de ação parece ser mediado pela interferência com o sistema GABAérgico e não envolve a ativação, pelo menos de forma direta, do sítio benzodiazepínico dos receptores GABA_A e que envolve o bloqueio dos canais para sódio dependentes de voltagem.

O presente estudo objetivou implantar, avaliar e comparar a eficácia de dois sistemas de desfluoretação de águas em duas localidades com problema de fluorose endêmica na zona rural de São João do Rio do Peixe, Paraíba. Os sistemas investigados foram Estação de Tratamento de Águas (ETA) e Filtro Desfluoretador Regenerável (FDR). O estudo foi dividido em duas partes, quais sejam: Parte I (avaliação de riscos: mapeamento dos teores residuais de flúor nas águas subterrâneas e percepção de fluorose dentária) e Parte II (redução de agravos: sistemas de desfluoretação). A amostra consistiu de 59 indivíduos de ambos os sexos e variadas faixas etárias; sendo 29 para o estudo da ETA (poço com 5,3 mg/L de flúor) e 30 para o do FDR (poço com 2,6 mg/L de flúor). Para investigar a estimativa de ingestão de flúor foi realizada a coleta de água, outros líquidos, alimentos pela metodologia do prato duplicado. Para crianças a estimativa de ingestão de flúor por dentifrício foi realizada com escovação simulada. Os valores de excreção de flúor foram estimados por coleta de urina de 24 horas. Todas as amostras coletadas foram armazenadas sob refrigeração e analisadas por eletrodo específico para flúor através de método direto e indireto por difusão com hexametildisiloxano (HMDS) quando apropriado. As avaliações foram realizadas em dois momentos distintos D1 (baseline) e D2 (1 a 2 meses após a desfluoretação), para ambos os modelos de desfluoretação (-ETA e -F). As análises estatísticas foram realizadas através do software Statistical Package for Social Sciences (SPSS), com p<0,05. Observou-se que a ingestão total de flúor bem como sua excreção diminuiu após a instalação dos dois modelos de desfluoretação, tanto o de base comunitária (ETA) como o de base domiciliar (FDR), indicando assim a eficácia desses modelos quanto ao controle de níveis ideais de flúor na água destinada ao consumo humano. O mapeamento da concentração de flúor na água proveniente dos poços artesianos da zona rural de São João do Rio do Peixe – PB confirmou o risco de fluorose dentária naquele município. Das amostras analisadas, 63,9% apresentaram [F] acima do valor ideal de 0,7 mg/L e 35% apresentaram valores acima de 1.5 mg/L. Estimou-se que cerca de 2.465 pessoas tem o risco de desenvolver fluorose dentária e 1.057 indivíduos podem ser portadores de fluorose óssea. A água foi o componente da dieta que mais contribuiu para a ingestão diária total de fluoreto (50%) nas duas localidades. Observou-se que houve redução significativa na ingestão de total de flúor no grupo de crianças entre os períodos de D1-ETA (0,10 mgF/kg/dia) para D2-ETA (0,04 mgF/kg/dia); e D1-F (0,07 mgF/kg/dia) para D2-F (0,03 mgF/kg/dia), bem como para os grupos de adultos da ETA e do FDR. O período de regeneração na ETA foi superior ao do sistema FDR sugerindo a aplicação do sistema ETA em localidades com elevadas concentrações de flúor onde o FDR não seria eficaz (>3,0 mg/L). Conclui-se que os dois modelos de desfluoretação foram eficazes em reduzir a ingestão de flúor e, por conseguinte reduzir o risco de fluorose dentária. Apesar de ambos os sistemas serem eficientes em reduzir a biodisponibilidade de flúor entre os usuários, apenas o sistema de base comunitária (ETA) se mostrou indicado para localidades com elevadas concentrações de flúor com risco de fluorose óssea.

No capítulo 1 desse trabalho, amostras do solo da pastagem nativa (sítio A) e sob cultivo do capim marrequinho (Paspalum conjugatum, Bergius) (sítio B), coletadas na região semi-árida do bioma Caatinga, Paraíba, (07°23’27”S 36°31’58”O), foram utilizadas para construção de quatro bibliotecas de clones metagenômicos, para avaliação da diversidade microbiana pela amplificação do gene 16S rRNA dos domínios Bacteria e Archaea, de cada amostra de solo. Os DNA metagenômicos foram extraídos utilizando FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), os quais foram amplificados por PCR utilizando primers universais, 27F / 1525R (Bacteria) e 20F / 958R (Archaea). Os fragmentos purificados foram ligados ao vetor pGEM Teasy e transformados por choque térmico em Escherichia coli DH10B quimicamente competente. Os transformantes foram cultivados em meio Agar LB/Ampicilina (100 µ/mL), IPTG (800 µg/µL) e XGal (80 µg/µL), a 37ºC/18-20 h. Foram selecionados 250 clones de cada biblioteca os quais foram sequenciados e após descarte das sequências de baixa qualidade e quiméricas, foram obtidas 64 e 68, 89 e 141 sequências para Bacteria e Archaea, nos solos dos sítios A e B, respectivamente, as quais foram comparadas em banco de dados públicos RDB e NCBI (≥95% de similaridade). No sítio A o filo Acidobacteria (48,4%) foi o mais abundante, seguido dos filos Bacteroidetes (10,9%), Proteobacteria (10,9%), e Firmicutes (6,3%). No sítio B Proteobacteria (45,6%) foi o de maior destaque, seguido de Firmicutes (10,3%), Acidobacteria (8,8%), Bacterioidetes (7,3%); e ainda Cyanobacteria (1,5%) e Planctomycetes (1,5%), que não foram encontrados no sítio A. Entre as sequências geradas, 23,4% (sítio A) e 25,0% (sítio B) não foram classificadas (similaridade <95%). No domínio Archaea foram encontrados os filos Euryarchaeota (3,4 e 45,4%) e Crenarchaeota (2,2 e 3,5%), nos sítios A e B, respectivamente; destacando-se que 94,4% e 51,1% das sequências não foram classificadas (similaridade <95%), entre os sítios A e B, respectivamente. Uma maior diversidade (índice de Shannon), riqueza (índice Chao 1) e distribuição (índice de equidade) das comunidades foram observadas no nível de espécies, tanto para Bacteria como para Archaea, nos dois sítios. As bibliotecas de clones metagenômicos 16S rRNA de Bacteria e Archaea, quando comparadas, utilizando-se o programa Libshuff, diferiram significativamente (p<0,0001). Os resultados desse estudo mostraram a ocorrência de uma grande diversidade de bactérias e arqueas, nesse tipo de ambiente pouco estudado e com características peculiares de temperatura elevada e limitações hídricas, com possibilidade de busca de novos genes e/ou isolados microbianos, com potencial biotecnológico. No capítulo 2 desse trabalho, foi investigado o potencial de produção de celulases e xilanases de clones metagenômicos e de cepas bacterianas de uma amostra do solo nativo da Caatinga, do Cariri paraibano. Foram utilizados dois procedimentos: solo pré-enriquecido (PE) (25 g do solo em 225 mL em meio contendo 1% de CMC), a 37ºC/18-20h, a 200 rpm, utilizado tanto para extração do DNA metagenômico do solo (Kit MOBIO), como para isolamento de cepas bacterianas a 37ºC e a 50ºC; e solo não-enriquecido (NE) (25 g do solo em 225 mL de solução salina 0,9%), do qual foram igualmente isoladas bactérias a 37ºC e a 50ºC. O DNA metagenômico do solo (PE) foi quantificado e fragmentado com EcoRI, obtendo-se bandas, entre 4 a 5 kb e 9 a 10 kb, que após purificação foram ligadas em vetor pBC SK, transformados em E. coli DH10B, por choque térmico, as quais foram cultivadas em Agar LB/Amplicilina (100 µ/mL), IPTG e XGal, a 37ºC (18-20 h). Das colônias brancas obtidas foram selecionados 3.840 clones, que foram repassados para placas 96 poços e estocados a -80ºC, dos quais 1.920 clones foram utilizados para avaliação das produções enzimáticas. Entre os clones testados foram obtidos 60 para produção de celulase e 10 para produção de xilanase; sendo então selecionados quatro clones xilanolíticos para extração plasmidial e re-transformação em E. coli, os quais confirmaram atividade para xilanase. Dos solos PE e NE foram isoladas 42 cepas, entre as quais, três isoladas do solo PE (Cel55-01; Cel55-02 e Cel37-03), identificadas pela amplificação do gene 16S rRNA como Bacillus subtilis e duas do solo NE (Cel37-28 e T2), denominadas Paenibacillus illinoisensis e P. favisporos, respectivamente. As cepas Cel55-01, Cel55-02 e Cel37-03 obtiveram baixo rendimento para celulase (0,050 a 0,061 U/mL) e xilanase (0,011 a 0,036 U/mL), avaliados pelo método de Somogyi-Nelson, quando cultivadas em LB/palha de arroz. No entanto, a cepa Cel55-01, quando cultivada em LB/bagaço de cana-de-açúcar, teve seu rendimento aumentado em cerca de dez vezes em relação à xilanase (0,30 U/mL), com temperatura e pH ótimos a 50ºC e. 6,0, respectivamente. As cepas Cel37-28 e T2 apresentaram atividade de 1,30 U/mL e 1,0 U/mL, após 2 min de reação, e 0,92 U/mL e 0,90 U/mL, após 15 min, respectivamente, quando cultivas em LB/palha de arroz. Para as cepas Cel37-28 e T2, as temperaturas e pH ótimos foram, 55ºC e 60ºC e 7,5, respectivamente. As celulases visualizadas em gel SDS-PAGE (Zimograma) para a cepa Cel55-1 se apresentaram na faixa de 130 a 210 kDa, enquanto que as xilanases da cepa Cel37-28 ficaram em torno de 70 a 180 kDa; e da cepa T2, entre 50 e 130 kDa, evidenciando a produção de mais de uma enzima pelas cepas. Esses dados mostram que no solo do Cariri paraibano, região com características peculiares, como temperaturas altas e escassez hídrica, é possível a obtenção, tanto de clones metagenômicos funcionais, como isolados bacterianos, que produzem celulases e xilanases, a partir de resíduos industriais, a temperaturas acima de 50ºC e pH tendendo ao alcalino, de grande interesse nas indústrias têxteis e de celulose e papel.